「第95回全国高校サッカー選手権」への出場を懸けた長野予選が9月3日と4日の両日で2回戦が各会場で開催された。

　野沢南は辰野を5-1で下し、今夏の全国総体出場校の市立長野への挑戦権を得た。松本蟻ヶ崎と岡谷南の一戦は3-0で松本蟻ヶ崎が勝利し次戦で前回大会優勝校の東京都市大塩尻と激突する。また、梓川は1-0で篠ノ井を退け次戦で今大会初登場となる前回大会4強の創造学園と対戦する。

　その他、岡谷東、豊科、飯田らが勝利し2回戦突破を決めた。尚、市立長野や東京都市大塩尻らが初登場する3回戦16試合は10月8日、伊那市陸上競技場などで行われる。

2回戦

日程	対戦カード
2016.09.03	辰野	1 - 5 試合終了	野沢南	(0)
2016.09.03	須坂	0 - 0PK 負 - 勝 試合終了	諏訪清陵	(0)
2016.09.03	北部	0 - 9 試合終了	上田東	(0)
2016.09.03	上伊奈農	6 - 3 試合終了	松川	(0)
2016.09.03	大町岳陽	0 - 2 試合終了	田川	(0)
2016.09.03	梓川	1 - 0 試合終了	篠ノ井	(0)
2016.09.03	松本蟻ヶ崎	3 - 0 試合終了	岡谷南	(0)
2016.09.03	伊那弥生ケ丘	6 - 0 試合終了	木曽青峰	(0)
2016.09.03	岡谷東	4 - 0 試合終了	飯田風越	(0)
2016.09.03	岩村田	0 - 3 試合終了	伊那北	(0)
2016.09.03	松本工	2 - 2PK 負 - 勝 試合終了	長野工	(0)
2016.09.04	小諸	6 - 1 試合終了	長野南	(0)
2016.09.04	合同チーム	0 - 6 試合終了	丸子修学館	(0)
2016.09.04	塩尻志学館	1 - 3 試合終了	小諸商	(0)
2016.09.04	豊科	1 - 0 試合終了	松本深志	(0)
2016.09.04	飯田	4 - 0 試合終了	長野西	(0)